碱裂解法提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳应该是什么样的?

jade1001 1年前 已收到2个回答 举报

leetaotao 幼苗

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一般都有3条带.据推测跑在最前边的是cccDNA(共价闭合环),中间的是OC(开环),最后的有点拖带,稍宽,早期多认为是线状的,但后来专家认为断链质粒发生几率很低,形不成条带,因此现在一般认为是处于复制过程中的1.5倍左右的条带.
以上均为推测,每人真的去证明.
但若将质粒提取液单酶切,将会得到整齐的一条带.我实验室经常用这种方法估计质粒的纯度.

1年前 追问

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jade1001 举报

老师留了一个思考题:测定实验所提取的质粒DNA的紫外吸收值确定的含量,这个值比实际DNA含量的值偏大还是偏小,why?

举报 leetaotao

偏小。 核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰,之所以能吸收紫外光,是由嘌呤环和嘧啶环的共轭双键所决定的。依据紫外吸收值大小估计DNA含量是 假定核酸分子比较小(数十个bp长度),所以碱基都能吸收紫外光,此时吸光度跟核酸长度(含量)成正比,是一个大概估计值,并不精确。定义1OD 的吸光值相当于50μg / ml 的(短链)dsDNA。 质粒由于具有长螺旋结构,使得碱基难以完全暴露在外,导致吸光度相对降低;此外质粒分子大小也远远大于一般 合成的线性DNA分子,也会导致吸光度相对降低。所以,采用UV测定所得的质粒浓度(ug/ml)比实际的浓度偏低。

jade1001 举报

十分感谢。谢谢你。 再问个问题:芽孢杆菌,OD600=1 与OD600=2浓度是2倍关系,那所含菌数是什么关系。好像不是2倍关系了。 还有怎么确定一定的OD 值所含的菌数。

举报 leetaotao

理论上 OD和菌数呈正相关。但OD测定中的直接测定数值应介于0.2-0.8之间。所谓的OD=2 应该是换算值。如果你测定的直接数据大于1,那么,所测定的OD偏小,直接测定的OD越大,距离真实值越远。

yxbmm 幼苗

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提的好的话会是一条单一的条带,是超螺旋结构。有时会是两条带或三条带,就要看提的质量了。

1年前

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