DEPC水的制备方法与具体操作
DEPC水是分子生物学实验中用于灭活RNase的关键试剂，其制备核心是将焦碳酸二乙酯（DEPC）与超纯水混合以共价修饰RNase，使其失活。具体操作步骤如下：首先，在通风橱中，向1升超纯水中加入1毫升DEPC原液，使其终浓度为0.1%（v/v）。随后，使用磁力搅拌器剧烈搅拌溶液至少1小时，确保DEPC完全分散溶解。然后，将溶液在室温下静置过夜（通常12小时以上），使DEPC与水中可能存在的RNase充分反应。最后，必须通过高温高压灭菌（通常121℃，15-20分钟）以分解溶液中残余的DEPC，因为DEPC会干扰后续酶促反应（如逆转录、PCR）。灭菌后得到的即为无菌、无RNase、无DEPC的DEPC水。
制备过程中的关键注意事项
制备DEPC水时，安全与细节至关重要。首先，DEPC具有毒性且疑似致癌，所有操作必须在通风橱内进行，并佩戴手套和防护眼镜。其次，DEPC与胺类物质（如Tris缓冲液）会发生剧烈反应，因此不可直接用DEPC处理含Tris的溶液，而应使用DEPC水来配制。在灭菌环节，务必确保灭菌彻底，因为未分解的DEPC会羧甲基化RNA和蛋白质，影响实验结果。灭菌后，可短暂打开高压锅盖让热气散发，避免冷凝水回滴污染。制备好的DEPC水应标明日期，分装于无菌无RNase的容器中，通常可在4℃保存数月。为验证效果，可用其配制RNA电泳胶进行测试。
应用与储存要点
制备成功的DEPC水主要用于配制RNA实验相关的所有溶液（但需注意前述的胺类物质兼容性问题），以及清洗实验器材以去除RNase。储存时，分装是延长有效期和避免污染的好方法。每次使用前，检查容器密封性，并确保取用工具（如移液器吸头）无菌且无RNase。虽然DEPC水是RNA工作的基础，但对于某些极度敏感的实验，直接购买商业化的无酶水也是可靠选择。遵循严谨的制备与操作规范，是获得高质量RNA实验数据的重要保障。