荧光定量PCR的引物如何设计..

荧光定量PCR的引物如何设计..
新手想问一下...做几个基因的定量.然后这几个基因的序列似乎没有,只在相近物种中的序列已经测过了..
..需要先做什么测序么
我爱肖艾 1年前 已收到3个回答 举报
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莠x 幼苗

共回答了16个问题采纳率：100% 举报

如果你测定的基因序列未知,可以用同源基因或者别的物种的同类基因序列来设计引物,进行PCR,看看是否能够扩增出产物,并对产物进行确认,判断扩增的特异性.
如果确认无误,就可以进行荧光定量PCR.

1年前 追问

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我爱肖艾 举报

我想请您看一下楼上的回答。。我是不是可以先用您说的办法做一下。。。然后再开始做RACE。。。

举报 莠x

不需要吧，如果你能确认设计的引物能特异性扩增PCR模板，可以直接加入荧光染料SYBR GreenI，它只在与DNA双链结合后会产生荧光。根据荧光的强度就可以知道PCR产物实时积累的情况了。但是这只能测定PCR体系中的全部双链DNA，而不是靶DNA。 如果需要测定特异性靶DNA扩增情况，需要设计特异性的荧光探针，如TaqMan探针，这种探针就需要根据靶基因的DNA序列来设计了，需要测序后进行设计。或者如果能够确保同源的基因或别的物种的同类基因序列能够特异性结合到靶基因上，也可以用来设计TaqMan探针。

我爱肖艾 举报

那再请教一下。。。我怎么才能确认我的产物是我想要的那个。。。

举报 莠x

比如限制性酶切图谱，比如探针杂交等等， 如果已经克隆了该基因，那么可以研究其限制性酶切图谱，与PCR产物的限制性酶切图谱进行比对 如果你的基因在其他物种中有同类基因，可根据同类基因设计探针，对PCR产物进行Southern Blot之类的，这样就可以确认扩增产物的特异性了

小兔灰灰 幼苗

共回答了6个问题 举报

最理想的是有特异引物，实在没有就根据同源基因保守片段设计兼并引物，
但是定量PCR都是作为一种检测方法看待的，如果你建立的检测方法连起码的特异性都不具备，结果怎么能有说服力！嗯。我是想设计特异性引物。但是不知道序列。所以问一下是不是要用什么办法把全长弄出来去测序。。。...

1年前

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囹圄 幼苗

共回答了2个问题 举报

首先根据其他物种中的序列设计兼并引物，在你做的物种中先把这几个基因的保守片段扩增出来，然后设计RACE引物，将全长cDNA序列扩增出来，经测序比对后最终确认。
然后，根据这几个基因的序列同源性比对结果，在同源性最低的区域设计各自的荧光定量PCR引物，扩增片段大小最好控制在80-150之间。...

1年前

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