RAPD实验PCR需要加多少模板

RAPD实验PCR需要加多少模板
如题.看到有的文献上说50ng.因为我提取的是小量的DNA.样本有限.加多少有没有要求的
城市孤鸟 1年前 已收到2个回答 举报
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水无缺 幼苗

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最好不要太低,否则条带不清晰,一般我们会加50~100ng/体系,但是DNA样品实在有限的话可以通过适当提高循环数来得到清晰的条带.
不过模板越少,PCR效果会打折扣的.
还有,模板少,另外其它组分的用量不变的话,引物二聚体会增多,引物非特异性结合的概率会小小增高,当然,最主要的还是影PCR产量.
刚才看了,你是做RAPD,模板少的话条带会比较少的,多态性也不太容易出来,要么你再提DNA,要么你降低退火温度,提高循环数试试

1年前 追问

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城市孤鸟 举报

悲催啊。谢谢你。 降低退火温度不会导致非特异性结合增加啊。。。我刚开始做RAPD 还不是很清楚。。

举报 水无缺

会的啊，不过RAPD的稳定性本来就是比较低的，因为退火温度只有36℃，并且这种标记在设计的时候就允许错配的发生，使得能够得到更多的条带。 文献上查到的是25微升体系中加20ng左右，你可以采用20微升体系，适当少加一点点模板试试。如果继续提DNA对你是很大的困扰的话，增加循环数应该是最保险的办法了。

想了半天没想到 幼苗

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用模版DNA稀释40-50倍左右，你也可以用分光光度计先检测你的DNA模版浓度。PCR反应的DNA模版不能超过1ng。然后设置梯度进行PCR。我25ul体系的模版加量一般是0.5ul 1ul 3ul 5ul。加的是稀释后的溶液不能超过1NG啊。。那会不会RAPD比较特殊一点。我看到文献上都要总量20ng以上。。我刚刚也找了一下资料。。你的RAPD是的模版用量是20ng那就又回到悲催的地方了。...

1年前

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