转基因为什么不能直接用PCR产物连接在表达载体上?

当然是可以直接将目标基因PCR后直接连到表达载体上的.但实际上在操作过程中,我们都是推荐先将目标基因的PCR产物连接到克隆载体上后再用于构建表达载体.原因是首先如果是未知序列的话,需要用克隆载体来对这段序列进行测定,然后好确定序列中的酶切位点,为下一步表达载体的构建策略提供必要的信息.然后,即使是序列很确定的基因,一般也会先装在克隆载体上.主要是因为你没办法保证你的序列的重复性.如果直接用PCR产物的话,由于你的模板并不一定是完全一致的,即使有少量的mRNA有碱基错配,很有可能就在PCR反应中这些错误的mRNA反转录的cDNA就被无限放大了,这样你连上去的序列就不一定准确了.但如果是装入克隆载体的序列,从克隆载体上获得的序列就有绝对的一致性,这样结果才有说服性.最后一点就是,连在克隆载体上的片段是很稳定的,你以后进行实验的时候还能保证可以获得完全一致的片段.但如果重新RT-PCR,这结果就有几率不同了.当然,对于已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的,这样做实际上是为了实验结果的严谨.

酷似是为了测序方便，有时候表达载体不能进行测序，或者说不方便，就需要经过一次亚克隆。当然，如果表达载体可以用通用引物测序就可以一步到位进行连接，测序证实没有突变就可以去表达了。

一是测序方便，有通用引物嘛~二是提高连接效率~