刚刚学做克隆,看到网上有两种平末端DNA加A尾方法,一种是切胶回收后加,另一种是直接加在PCR产物中,想请问:

刚刚学做克隆,看到网上有两种平末端DNA加A尾方法,一种是切胶回收后加,另一种是直接加在PCR产物中,想请问:
1.第二种加A方法,加Taq酶和dNTPs了,还要不要加buffer~
2.是在PCR 72度延伸时暂停加效果好,还是PCR后,再加效果好~
3.如何鉴定是不是加A尾成功了?有没什么方法做个阳性对照?
4.要不要加A尾成功了,再进行一次纯化,然后再连接载体呢?
abcpk00099 1年前 已收到1个回答 举报

ieea23134 幼苗

共回答了12个问题采纳率:100% 举报

1 一般不需要,你可以比对你用的高保真酶的buffer和Taq酶的buffer,要加也只能加差异的部分,如果直接加buffer里面离子浓度肯定都不对了;
2 都可以,不过我觉得还是应该在充分延伸后暂停或重新换程序;
3 TA克隆成功说明加A成功;如果要做阳性对照就用Taq酶直接PCR一管;
4 一定要纯化,不然里面全是A,你得到的就大部分是假阳性!

1年前

4
可能相似的问题
Copyright © 2024 YULUCN.COM - 雨露学习互助 - 16 q. 0.426 s. - webmaster@yulucn.com