求不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法操作步骤

博凌科为生物科技-为你不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1.2）取一50ml聚乙烯管,无菌采集人外周静脉血,加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml.上述全血300gX20min,离心,室温.3）吸出富含血小板的上清,2500gX15min,制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma,PPP）.4）余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000,用无菌生理盐水配制),并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml,轻轻、彻底混匀.室温沉降30min.5）吸出富含白细胞的上层液,275gX6min.6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新 鲜配制)、2~3ml细胞悬液,275gX10min.8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间,中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间.血小板可通过 25%Percoll离心5min去除,也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除.9）中性粒细胞层用PPP液冼1次,再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD,PH7.23）洗1次.10）用这种方法可得80%中性粒细胞,纯度在95%以上.