做pcr,如何确定最佳退火及延伸的时间和温度?

christinaDu 1年前 已收到2个回答 举报
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愿楚一生好 种子

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延伸一般都是72° 时间是根据酶的种类和片段长度决定的
退火温度根据引物来决定 一般先用55° 不行的话再往下降

1年前 追问

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christinaDu 举报

额，书上都这么写。 但是怎么根据情况来决定呢？每次都觉得摸不着头脑。

举报 愿楚一生好

一般的taq酶是一分钟1kb 别的酶可以看看说明书是什么速度 然后看你片段多大就可以算出延伸时间了啊 别的没啥摸不着头脑的吧

christinaDu 举报

你们现在用的DNA模板，是什么来源？ 还经常组织块提取吗？

举报 愿楚一生好

不同实验室差别很大好不好 我们主要用细胞系的cDNA

christinaDu 举报

呵呵，我们实验室也是诶。谢谢啦。

罗汉说爱你 幼苗

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退火的目的是为了使引物和DNA单链结结合，所以退火温度一定要低于目的DNA和引物的熔点温度。一般情况下引物的熔点温度为40~70度，熔点温度的高低与引物的大小与G+C的比例有关。延伸的温度取决于DNA聚合酶的最适温度，聚合的错配率，引物的熔点温度。最常使用的延伸温度为72度。但是根据你要扩增的产物与引物还是会有差距。...

1年前

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