primer5.0引物设计所用序列为什么是mRNA?

primer5.0引物设计所用序列为什么是mRNA?
做qRT-PCR时设计引物是直接将NCBI的mRNA区域中CDS区序列拷贝到primer5.0里面,可是做qRT-PCR前不是有一步是将RNA逆转录成cDNA吗?那以mRNA设计引物不是反了吗?我觉得是应该以mRNA的互补序列设计引物才对啊?
golden_hawk 1年前 已收到1个回答 举报
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369D 春芽

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设计引物的时候已经用到了两条链吧,一条链设计前引物,另一条设计后引物.RT-PCR得到的是双链cDNA,所以用mRNA设计或者用互补链设计都可以啊,因为着两条链都会用到,只要把U换成T,是绝对可以P出来的.

1年前 追问

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golden_hawk 举报

谢谢，可是逆转录后得到的是双链cDNA？mRNA不是单链吗？而且逆转录时用的引物不是试剂盒里面自带的oligo dT和Random6吗，所以得到的不是单链吗？

举报 369D

逆转录分三步，第一步是以mRNA为模板形成一条单链cDNA，第二步是水解mRNA，第三步是以单链cDNA为模板形成双链cDNA。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA 3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA 5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子
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