双抗体夹心法测抗原含量的实验过程中需要注意哪些问题?哪些因素会影响结果?质控点是什么?

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.
2） 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.
洗涤除去其他未结合物质.
3） 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合
的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.
4） 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.
在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合
物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相
载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标
抗体一起保温反应,作一步检测.
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标
抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应
后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
吸光值相同（参见1.3.2,图1-4）,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现
象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重
时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时,应注意可测范围的最高值.用
高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰.RF是一种自身抗
体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用
F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体
夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）.
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小
分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.