质粒转入细胞后使用抗生素G418怎样检测到阳性克隆

G418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成,阳性克隆中因含有抗性基因可以存活.
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质,所以筛选不能太早
一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选.随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液,这时药物浓度可以降至200ug/ml
加药后,在高倍镜下,阳性克隆和阴性克隆很容易辨认,在阳性克隆下用记号笔做个标记.然后刮除阴性克隆,消化阳性克隆后继续筛选培养,最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选
一般经过4周左右的筛选,得到的阳性克隆才都比较稳定

向转染后的细胞中加入一定浓度的G418，一段时间后，不死，存活下来的就是阳性克隆。