请教分子标记SSR标记（STMS）原理和步骤

SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列,指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200bp以下.研究表明,微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富,而且常常是随机分布于核DNA中.
微卫星中重复单位的数目存在高度变异,这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同,因而造成多个位点的多态性.如果能够将这些变异揭示出来,就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性,基于这一想法,人们发展起了SSR标记.
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS,是目前最常用的微卫星标记之一.由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列,因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序,然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增,从而将单个微卫星位点扩增出来.由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异,个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性,这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP),每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因.由于SSR重复数目变化很大,所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性,这就是SSR标记的原理.
与其它分子标记相比,SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传,呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物.因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11,12,18,19,33〕、目标基因的标定〔8,9,21,22,26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中.但应看到,SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究,因而其开发费用相当高,各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记.由于SSR标记具有较大的应用价值,且种属特异性较强,目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作,共同进行STMS引物的开发.
操作步骤
1、在25μl反应体系中,加入
模板DNA 1μl（20ng）；
SSR引物 1μl（0.15μM）
10×PCR缓冲液 2.5μl
MgCl2 2μl (25mM)
dNTP 2μl (0.2mM)
Tap 酶 1单位
加ddH2O至 25μl
2、反应在PE 9600热循环仪上进行.PCR反应先95℃变性4min,接着94℃ 45s、55℃ 30s和72℃ 60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min.PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离.点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压1500V,时间约2～3h.DNA染色采用银染法.电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染色、显影、固定等步骤染色.电泳和银染具体操作与AFLP相似.
3、数据分析：
用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计,再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数,用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图.